ЯМР как аналитический метод

Однако при использовании широкополосной развязки возникает проблема, состоящая в том, что образец подвергается облучению дополнительным полем в течение достаточно длительного времени. Это особенно сильно сказывается на водных растворах и растворах электролитов, которые достаточно сильно поглощают РЧ излучение, что приводит к разогреву образца. Изменение температуры сказывается на виде спектра in-vitro, а для чувствительных к изменению температуры биологических молекул может приводить к необратимой денатурации. При проведении исследований in-vivo это может привести к потенциально более вредному воздействию, а именно, разрушающему перегреву тканей.

Применение метода ЯМР для определения концентраций

Задача определения концентраций с помощью метода ЯМР в идеальном случае представляется достаточно простой. Так как площадь под резонансной линией пропорциональна числу ядерных спинов, то она пропорциональна также числу соответствующих ядер. При условии, что объем образца остается неизменным, число ядер пропорционально концентрации молекул, содержащих эти ядра. Это позволяет по величине площади определить значение относительных концентраций, а при соответствующей калибровке – значение абсолютных концентраций.

Рассмотрим вновь рис. Значения интегралов под отдельными резонансными линиями очевидно различаются. Соотношение площадей под сигналами, соответствующими гидроксильной, метиленовой и метильной группам, равно числу протонов в этих группах 1:2:3. Подобные рассуждения справедливы и при определении в смеси веществ относительных концентраций присутствующих в них компонентов. При этом здесь отсутствует необходимость в отнесении всех резонансных линий, необходимо лишь установить принадлежность хотя бы одной резонансной линии к соответствующей молекуле при условии, что в спектре отсутствует перекрывание спектральных линий.

Несмотря на относительную простоту такого подхода, существует, однако, ряд факторов, ограничивающих точность метода. Большинство источников ошибок можно достаточно просто исключить. Поскольку методы определения концентраций играют большую роль, в частности, в спектроскопии in-vivo, более подробно обсудим возможности устранения ошибок в таких экспериментах.

Эффекты насыщения могут существенно влиять на интенсивность резонансных линий. Так как значения времен продольной релаксации для различных групп в молекуле могут варьироваться в широких пределах, то возможно настолько сильное насыщение, что в результате будет наблюдаться полное исчезновение некоторых резонансных линий. Это происходит в том случае, если скорость повторения и соответственно длительность импульса, определяющая угол отклонения вектора намагниченности, выбираются слишком большими. Если же в образце присутствуют ядра с различными значениями времен релаксации и нужно провести измерение относительной интенсивности линий с достаточно высокой точностью, то необходимо построить эксперимент таким образом, чтобы соблюдался баланс между максимальной чувствительностью и правильным значением интегральной интенсивности резонансных линий. Максимальная чувствительность определяется углом Эрнста, а точное определение площади под резонансным сигналом достигается тогда, когда длительность интервала между импульсами выбирается из следующих соображений: спин ядра с наибольшим значением времени релаксации T^max должен полностью прийти к состоянию термодинамического равновесия, прежде чем на систему воздействует следующий импульс. Для достижения этого условия необходимо, чтобы интервал времени между импульсными воздействиями на спиновую систему Tr в несколько раз превышал максимальное из значений времен спин-решеточной релаксации Timax: например, Tr = Srjmax.

Так как возбуждающий импульс характеризуется конечной шириной, то соответствующий спектр не для всех частот будет равноинтенсивным. Если длительность импульса слишком велика, то не все резонансные линии возбуждаются равномерно, что приведет, очевидно, к изменению их интенсивности, которая определяется разностью значений резонансной и опорной частот.

Для улучшения отношения сигнал/шум РЧ сигнал подвергается фильтрации с помощью аналогового фильтра. Такой фильтр позволяет пропускать только интересующую нас область частот. Так как частотная характеристика для аналогового фильтра не является строго прямоугольной, то сигналы по краям спектра несколько ослаблены.

При использовании аналого-цифрового преобразователя сигнал, принимающий в аналоговом представлении непрерывный ряд значений, преобразуется в ряд целочисленных значений. В этом случае определение площади под резонансной линией будет неточным, если на частотной оси отсутствует достаточно число точек для характеристики резонансной линии. Точное измерение концентрации также невозможно в случае, если цифровая фильтрация загрубляет данные о площади под резонансной линией, слишком большой шум или перекрывание с другими сигналами затрудняет процесс интегрирования. Если входной сигнал, поступающий на АЦП, является очень слабым, то осуществляющая возможность проведения преобразования позволяет получить лишь достаточно грубую информацию, так как в нашем распоряжении имеется небольшое число значений для описания данного сигнала. В предельном случае имеется только одно значение – нуль. При этом интеграл определяется с большой неточностью. Неточность можно устранить, если усилить сигнал настолько, чтобы можно было располагать достаточным числом значений. Определенные трудности возникают тогда, когда одновременно необходимо проинтегрировать очень слабый и очень сильный сигналы. В этом случае максимальное усиление входного сигнала определяется динамической областью АЦП. В Фурье-спектроскопии полный сигнал должен быть зарегистрирован без искажений, так как каждая точка, содержащаяся в спаде свободной индукции, может оказывать влияние на весь спектр. Таким образом, даже самый большой сигнал должен попадать в область значений АЦП. Для современных спектрометров с высоким значением статического магнитного поля и соответственно высоким значением рабочей частоты, как правило, используются 12- и 16‑разрядные АЦП, т.е. наибольший сигнал может превышать не более чем в 4096 = 2* раз и соответственно не более чем в 65536=2 6 раз наименьший сигнал для того, чтобы можно было зарегистрировать эти сигналы одновременно. Несмотря на то что приведенные величины весьма велики, такая ситуация встречается на практике нередко. Если, например, нужно зарегистрировать спектр вещества миллимолярной концентрации в воде, то сигнал воды примерно в 1 10000 раз интенсивнее сигнала вещества.

Если учесть все перечисленные возможности возникновения ошибок, то при соответствующих условиях можно определять концентрацию с точностью до нескольких процентов. Если используем внутренний стандарт и добавляем строго определенное его количество, то можем достаточно точно определить значение абсолютной концентрации. Если же условия проведения эксперимента не позволяют использовать внутренний стандарт для определения интенсивности, то это означает, например, в спектроскопии in-vivo, что при нахождении абсолютных концентраций всегда допускается некоторая неточность. В этом случае интенсивность резонансных линий определяется многими внешними факторами, в частности, точным расположением образца в приемной катушке и точностью настройки приемно-передающего тракта. Точность этих измерений всегда должна подвергаться критической оценке и сопоставлениям.

 Скачать реферат